Předkládaná diplomová práce se zabývá zavedením a optimalizací metody Real time-PCR pro detekci a kvantifikaci genu adiA. Tento gen kóduje arginindekarboxylasu, enzym, který je zapojen v metabolické dráze produkce putrescinu u gramnegativních bakterií. Putrescin je jeden z biogenních aminů; je to látka v potravinách nežádoucí, protože její výskyt je spojován s kažením potravin. V rámci diplomové práce byly speciálně pro Real time-PCR navrženy specifické sady primerů, které slouží k ohraničení úseku DNA (v genu adiA), který má být sledován a dále amplifikován. Bylo potvrzeno, že vybraná/použitá sada primerů je opravdu specifická a reakce probíhají s optimální účinností (90-110 %). V průběhu práce byla sledována genová exprese genu adiA, metodou relativní kvantifikace (dle Pfaffla), u Escherichia coli CCM 3954 v závislosti na časových podmínkách kultivace. Nejvyšší exprese (R=2000) genu adiA bylo dosaženo po 12 hodinách kultivace této bakterie v kultivačním médiu s přídavkem L-argininu. Toto zjištění potvrzuje fakt, že gen adiA je opravdu genem inducibilním.
Anotace v angličtině
The present thesis deals with an implementation and optimization of the Real time-PCR method for a detection and quantification of the adiA gene. This gene is able to encode an arginine decarboxylase enzyme, which is involved in the metabolic pathway of putrescine production in gramnegative bacteria. It is known that putrescine belongs to the group of biogenic amines, and it is an undesirable substance in food because its occurrence is often associated with deterioration of foodstuffs. In the experimental part of this thesis, specific sets of primers were designed specifically for the Real-time PCR. These sets of primers were used for a determination of a particular DNA section in the adiA gene that was further studied and amplified. It was found that the used sets of primers are truly specific with optimum reaction efficiency varied between 90 to 110 percent. Further, gene expression of the adiA gene has been monitored by using Relative Quantification method (Pfaffl) in Escherichia coli CCM 3954 during different time cultivation. The highest expression of the adiA gene in CCM 3954 (R=2000) was achieved after 12 hours of cultivation in growth medium supplemented with L-arginine. It may be concluded that this finding clearly confirms the inducibility of the adiA gene.
Klíčová slova
putrescin, Real time-PCR, relativní exprese, adiA
Klíčová slova v angličtině
putrescine, Real time-PCR, relative expression, adiA
Rozsah průvodní práce
85 s. (92 449 znaků)
Jazyk
CZ
Anotace
Předkládaná diplomová práce se zabývá zavedením a optimalizací metody Real time-PCR pro detekci a kvantifikaci genu adiA. Tento gen kóduje arginindekarboxylasu, enzym, který je zapojen v metabolické dráze produkce putrescinu u gramnegativních bakterií. Putrescin je jeden z biogenních aminů; je to látka v potravinách nežádoucí, protože její výskyt je spojován s kažením potravin. V rámci diplomové práce byly speciálně pro Real time-PCR navrženy specifické sady primerů, které slouží k ohraničení úseku DNA (v genu adiA), který má být sledován a dále amplifikován. Bylo potvrzeno, že vybraná/použitá sada primerů je opravdu specifická a reakce probíhají s optimální účinností (90-110 %). V průběhu práce byla sledována genová exprese genu adiA, metodou relativní kvantifikace (dle Pfaffla), u Escherichia coli CCM 3954 v závislosti na časových podmínkách kultivace. Nejvyšší exprese (R=2000) genu adiA bylo dosaženo po 12 hodinách kultivace této bakterie v kultivačním médiu s přídavkem L-argininu. Toto zjištění potvrzuje fakt, že gen adiA je opravdu genem inducibilním.
Anotace v angličtině
The present thesis deals with an implementation and optimization of the Real time-PCR method for a detection and quantification of the adiA gene. This gene is able to encode an arginine decarboxylase enzyme, which is involved in the metabolic pathway of putrescine production in gramnegative bacteria. It is known that putrescine belongs to the group of biogenic amines, and it is an undesirable substance in food because its occurrence is often associated with deterioration of foodstuffs. In the experimental part of this thesis, specific sets of primers were designed specifically for the Real-time PCR. These sets of primers were used for a determination of a particular DNA section in the adiA gene that was further studied and amplified. It was found that the used sets of primers are truly specific with optimum reaction efficiency varied between 90 to 110 percent. Further, gene expression of the adiA gene has been monitored by using Relative Quantification method (Pfaffl) in Escherichia coli CCM 3954 during different time cultivation. The highest expression of the adiA gene in CCM 3954 (R=2000) was achieved after 12 hours of cultivation in growth medium supplemented with L-arginine. It may be concluded that this finding clearly confirms the inducibility of the adiA gene.
Klíčová slova
putrescin, Real time-PCR, relativní exprese, adiA
Klíčová slova v angličtině
putrescine, Real time-PCR, relative expression, adiA
Zásady pro vypracování
1. Vypracovat literární rešerši, která se bezprostředně týká daného tématu. Pozornost zaměřit zejména na metodu Real Time-PCR.
2. Zavést metodu Real Time-PCR pro detekci vybraného genu.
3. Analyzovat genovou expresi relativní kvantifikací.
4. V závislosti na časových možnostech uskutečnit další experimenty s reálnými vzorky. 5. Teorii, metodiku, výsledky experimentů a diskusi sepsat do formy diplomové práce.
Zásady pro vypracování
1. Vypracovat literární rešerši, která se bezprostředně týká daného tématu. Pozornost zaměřit zejména na metodu Real Time-PCR.
2. Zavést metodu Real Time-PCR pro detekci vybraného genu.
3. Analyzovat genovou expresi relativní kvantifikací.
4. V závislosti na časových možnostech uskutečnit další experimenty s reálnými vzorky. 5. Teorii, metodiku, výsledky experimentů a diskusi sepsat do formy diplomové práce.
Seznam doporučené literatury
Vědecké databáze (Web of Science), vědecká a odborná literatura.
Seznam doporučené literatury
Vědecké databáze (Web of Science), vědecká a odborná literatura.